Sanger測序

起步于承擔人類基因組計劃和多項全基因組測序重大項目,諾賽基因的DNA測序平臺是您的研究工作最可信賴的技術支撐和合作伙伴。世界一流的儀器設備與近十年對外測序服務經驗的完美結合,輔助以標準化的流程和全程監控的質量保障和質量控制系統,諾賽基因的大規模、高通量、自動化的DNA測序平臺致力于為國內和國外客戶提供高質量、高性價比、高效的測序服務。

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服務流程

1.制備樣品

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2.仔細閱讀填寫登記表

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3.發送登記表至一代測序服務郵箱([email protected]

4.郵寄樣品至諾賽基因

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服務優勢

20sanger測序經驗

參與“人類基因組計劃”1%人類基因組測序任務開始......


多臺ABI 3730XL測序儀

測序能力上千萬PHRE20堿基。


合格反應,QV20+ > 800bp

QV20+,即堿基準確度大于99%。


合格率 > 90%

每板設陰性,陽性對照。

困難模板測序

發卡序列,高GC含量,重復序列。

LIMS樣品信息管理系統

一個樣品,一個ID;QA現場監督。


技術應用
精準醫療領域
精準測序驗證?
微生物鑒定領域
科學研究領域

1.為什么過短的PCR產物不適于直接測序?


首先純化過短的PCR產物比較困難,一般的PCR產物純化試劑盒都要求PCR產物片段大于150bp,而且過短的PCR產物的準確定量也非常困難。其次,模板太短的PCR測序受外界的干擾比較大,很容易造成測序失敗。因此我們要求用于測序的PCR產物的長度一般不低于150bp。(一代測序是測引物后面的序列,由于引物后面30~50個堿基測序不準確,考慮到正反向測序能得到全長序列,所以要求用于測序的PCR產物的長度一般不低于150bp。)





2.DNA片段很長,一個反應測不到頭,怎么辦?


可以分別用兩端引物進行雙向測序,讓其中間部分的序列交叉互補,便可完全測通。如果這樣還測不通,可在已經測出序列的500700個堿基處設計測序引物作進一步測序(即Primer Walking),便可完全測序。





3.為什么在primer walking時總將引物設計得那么靠前


我們在設計引物時有兩個準則。一是用于設計引物的序列必須準確,二是在引物區之后還必須有足夠的準確序列用于拼接。這樣我們設計引物的位置就必然在已測序的準確序列的末尾之前一段位置上,在滿足軟件設定的條件下,我們總會選取最靠近3’端的引物來作為最終的測序引物。


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4.我有一個4KB的P?CR片段,希望你們幫我測通。

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大于3KB的PCR片段要測通最好是構建到克隆后再進行測序。這樣模板更加穩定,測序效果也更加好一些。




 

5.PCR片段直接測序和PCR片段經克隆后測序的結果有何區別?

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眾所周知,PCR擴增過程中會出現錯配現象,但不可能所有的錯配都發生在同一位置。PCR片段直接測序時,測得的是PCR產物眾多分子混合物的結果。若某一個位點上出現了錯配現象,一些PCR產物(約幾十個分子)在該位點上存在錯配,但大多數分子(約幾十萬個分子)在這個位點上還是正確的,因此測序時,錯配現象是反映不出來的。而PCR片段經克隆后測序是測定某一個PCR產物分子的DNA序列。在幾十輪循環的PCR擴增過程中,很難保證某一個分子的任何位點都不發生錯配。因此,PCR片段經克隆后的測序結果,往往存在著一些錯配的序列,和PCR片段直接測序的結果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現象的多少取決于PCR擴增時使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴增過程中的錯配現象,在PCR反應時,請選用保真性能高的DNA聚合酶。

 




6. 我測得的基因序列為什么與標準序列有差別?


原因可能是:

①PCR擴增過程中產生錯誤; 
②載體擴增或保存過程中發生突變;
③ABI公司承諾其儀器的測序精度在一定范圍內可以達到98.5%以上。
解決措施有:
①排除模板、PCR擴增或載體相關的錯誤;
②雙向測序。

 




7. 我要求5’到3’正向測序,為什么你們給我的序列是反的?


我們是按照您所選擇的引物來測序的,有可能該序列與您手中資料上的序列的方向相反,也可能是目標片段的插入方向與您預期的相反。填寫測序要求時,請不要使用3’引物和5’引物這樣的字樣,而應以T7,T3,SP6,M13f,M13r等形式來填寫,或注明酶切位點方向比如“測序方向EcoRI到HindIII”。如果您提供的載體比較特殊,還需要您提供質粒的相關圖譜等資料和信息。

 




8. 為什么我的測序序列起端有時會有一些N值?


該種情況主要發生在PCR產物直接測序上。由于PCR產物本身是一個混和溶液,相近的片斷又很難割膠純化出來,這樣和引物結合就很容易產生系列雜合序列就會造成在某些位置上有套峰,整個測序信號都非常好,這是由于套峰產生的N值。該種情況明顯是客戶的樣品問題。通過將PCR產物克隆后進行測序,可以解決此種情況的N值問題。

 




9. 為什么找不到我的PCR引物?


有以下幾種情況,我們將無法找到PCR引物序列:


(1)用PCR引物作為測序引物進行測序時,所測序列是從引物3’末端后第一個堿基開始的,所以自然找不到測序引物的序列。有兩種方法可以得到測序引物序列。①對于較短的PCR產物(<800bp),可以用另一端的引物進行測序,一直測到序列的末端,就可以在序列的末端找到 您的引物的反向互補序列。②對于較長的序列,一個測序反應測不到頭,可以將您的PCR產物克隆到適當的載體中(比如T載體),用載體上的通用引物進行測序。由于載體上的通用引物與插入序列之間還有一段距離,因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準確讀出,因此,您如果想得到您的PCR產物的完整序列,最好克隆后進行測序。


(2)PCR產物用T載體克隆后,由于克隆的方向是隨機的,因此,當您在一條鏈上找不到您的引物序列時,試圖在互補鏈上尋找您的引物序列。


(3)當測序引物離您的插入片段很近時,有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時測序的起始端有未去除的染料或引物二聚體的干擾,造成起始區的序列不好,可能無法找到您的引物完整序列。


(4)有時,質粒做模板進行測序時,由于某些原因,質粒上沒有插入外源目標片段,或為空載體,所測的序列完全為載體序列,此時自然也找不到引物序列。

 




10. PCR測序后面很多雜信號?


PCR產物直接進行測序,序列結束后無反應信號。PCR產物測序一般末端的一個堿基為A(綠色峰),這是由于Taq酶能夠在PCR反應的末端非特異性地加上一個A堿基,我們用T載體克隆PCR產物就是根據該原理的,這樣我們很容易辨別PCR產物結束的位點。在此序列以外就不是我們所要的序列了。

 




11. 測序結果不到800bp還照常收費了,為什么?


如果樣品的DNA序列分布勻稱,沒有復雜結構,正常的測序反應能保證達到800bp以上。但有一些DNA序列立體結構復雜,造成聚合酶延伸反應終止,測序信號突然減弱或消失,或者測序結果出現套峰現象,出現這些現象是由DNA模板本身所造成,諾賽會根據具體情況收取費用。

 




12. 我的樣品你們已經測通了,但為什么在overlap區有這么多的錯配,給出的全序列和單個報告也稱作差異,我該相信誰?


給出的全序列是一個拼接的結果,當互相拼接的兩個序列存在差異時,應該以序列質量更好為主。

 




13. 我的樣品送測序前已經鑒定過了,有插入片段的,為什么你給我的測序結果是一個空質粒?


造成這種現象主要有兩個原因:


? 鑒定過程中的假陽性。鑒定插入片段主要是通過PCR和酶切兩種方式鑒定。由于PCR反應受多種條件的影響,在鑒定過程中易產生假陽性,而酶切鑒定是比較可靠的鑒定方式。


? 我們由于條件的限制,無法單獨的對某一個客戶的樣品進行特定條件的培養,所以可能在培養過程中發生插入片段的丟失。由于這種情況的發生無法事先預期到,所以 我們也只能對出現這樣情況的客戶說抱歉。客戶可以直接提供質粒。

 




14. 測序完成后,測序樣品和引物將如何處理(或保存)?


客戶需要將測序樣品或引物(客戶自帶的)返還時,我們在測序完成的同時,按客戶要求返還樣品或引物(客戶自帶的)。對于沒返回的測序樣品,公司負責保存1個月(引物3個月),超過1個月還需測序的樣品,請客戶另行提供。

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